急性胰腺炎(acute pancreatitis， AP)是由多种病因引起的因胰酶相配激活消化胰腺本人及周围组织而激发的急腹症[1]，其中20%的患者会伴发器官功能辞让和(或)胰腺坏死组织感染(infected pancreatic necrosis， IPN)进展为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis， SAP)，病死率高达20%~40%[2-4]。SAP患者存在诸多激发血流感染(bloodstream infection， BSI)的高危要素，如侵入性操作、免疫禁锢状态、局灶性感染播散、病院感染、养分景况差等[5]成人黄色网站，易诱发脓毒症，加剧器官功能辞让，严重影响患者的预后。因此，快速、准确识别BSI病原体是一样抗菌药物使用的要津。当今，血培养(blood culture， BC)是BSI会诊的金尺度[6]，但受其工夫旨趣甘休，存在阳性率低、耗时长、采血量大、易浑浊等污点[7-8]，难以及时辅助临床诊治。微滴数字团员酶链反应(droplet digital PCR， ddPCR)行为第三代核酸扩增与检测工夫，通过平行的单分子扩增终止待检靶分子载量值的完全定量[9-11]，能同期对病原体及耐药基因进行多重检测，具有快速、高智慧度、不依赖尺度弧线等上风[12]，以及研究和临床利用前程。本研究基于SAP合并疑似BSI患者东谈主群，评价ddPCR的病原学会诊遵守，并探讨其临床利用价值。
1 对象与规范 1.1 研究对象及第2022年7—9月某院重症医学科收治的SAP患者，临床大夫怀疑BSI发生时，在归拢时刻、归拢部位采集患者静脉血标本。纳入尺度包括(1)依据纠正Atlanta尺度会诊为SAP[13]。(2)年岁≥18岁。(3)至少相宜两项全身炎症反应空洞征(SIRS)尺度：a)最高体温>38℃或＜36℃；b)心率>90次/min；c)呼吸>20次/min或PaCO2＜32 mmHg；d)白细胞计数>12.0×109/L或＜4.0×109/L。放手尺度包括(1)断绝抽血检测；(2)病历府上不好意思满。本研究有运筹帷幄经该病院医学伦理委员会批准(批号：2021NZKY-014-01)，纳入受试者均签署知情甘愿书。
1.2 检测规范 1.2.1 BC法按模范过程采集2套血标本并送至微生物现实室[6]，使用血培养仪(BD BactecTM FX40， 好意思国)按使用手册对血标本进行分析，使用Vitek®MS系统(BioMerieux， version 1.7， 法国)对培养阳性血标本进行菌种封闭，并进行药物明锐考试(antimicrobial susceptibility testing， AST)。
1.2.2 ddPCR法按模范过程采集5~10 mL静脉血于EDTA抗凝管中，2 h内离心(3 000 r/min，15 min)后采集血浆。按序取60 μL洗脱液、2 mL血浆、10 μL内对照、200 μL卵白酶K加至索求槽并置于核酸索求仪进行核酸索求，汇集洗脱液并以5 μL/管加入至含靶标的预混液试剂管中，放于标本制备仪(DG32，领航基因科技，中国)进行液滴制备，使用PCR扩增仪(TC1，领航基因科技，中国)按照“95℃ 5 min; (95℃ 5 s，60℃ 20 s) ×40轮回; 25℃ 5 min”轮回参数进行平行扩增，临了使用生物芯片阅读仪(CS7，领航基因科技，中国)分析并呈报病原体和耐药基因型的类别及载量值。
1.2.3 ddPCR检测范围检测范围包括15种病原体及5种耐药基因，分别为铜绿假单胞菌、暗沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、链球菌、念珠菌、嗜麦芽窄食单胞菌、柠檬酸杆菌、黏质沙雷菌、奇异变形杆菌、洋葱伯克霍尔德菌，以及耐药基因blaKPC、mecA、blaNDM/IMP、blaOXA-48、VanA/VanM。
1.3 数据汇集通过电子病历系统汇集患者的年岁、性别、肉体质地指数(BMI)、AP病因、初度检测距发病日数、初度检测当日器官功能赞助情况，汇集两种检测规范的效果及从上机至呈报最终效果的耗时，每次检测当日的病情严重度评分，以及现实室主义、检测前1周内的其他体液细菌培养效果等。
1.4 检测效果解读若是检测到一种或多种病原体认定为阳性效果，莫得检测到病原体认定为阴性效果。若是单次检测两种规范均为阴性或ddPCR检测菌种等同/包含BC效果，界说为效果一致；BC呈阳性，伦理 电影在线观看ddPCR呈阴性或检测菌种不等同/不包含BC效果，ddPCR效果界说为假阴性；当BC呈阴性，ddPCR呈阳性，则判定为可能血流感染或推定假阳性。可能血流感染是指ddPCR效果与检测前1周内非血标本病原学检测效果相符；推定假阳性是指ddPCR效果与检测前1周内非血标本病原学检测效果不相符[14]。AST阳性是指下述情况：AST瓦解对亚胺培南或好意思罗培南耐药，界说为碳青霉烯类耐药，对应ddPCR耐药基因型为blaKPC、blaNDM/IMP、blaOXA-48；AST瓦解对甲氧西林耐药，对应ddPCR耐药基因mecA；AST瓦解对长时霉素耐药，对应ddPCR耐药基因为VanA/VanM。
1.5 统计学分析利用SPSS 25.0软件进行统计分析，计量府上选拔均值±尺度差(x±s)神情成人黄色网站，计数府上选拔频数(率)神情；野心ddPCR检测的智慧度、特异度、阳性展望值和阴性展望值；选拔Spearman计议性分析野心ddPCR单次检测病原体载量与感染主义水平的计议性；双侧P≤0.05为互异有统计学真义。利用Graphpad Prism 9.0.0软件进行图绘画。
2 效果 2.1 一般府上本研究共纳入22例患者，年岁18~69岁，平均(42.4±15.3)岁，男性15例(68.2%)，初度检测时患者的平均C反应卵白(CRP)和降钙素原(PCT)值分别为194.8 mg/L、4.19 μg/L。见表 1。共送检血标本52份，ddPCR耗时[(0.16±0.03)d]低于BC耗时[(5.92±1.20)d；P＜0.001]。
波多野结衣 肛交 表 1 22例SAP患者一般府上与临床特征 Table 1 General data and clinical characteristics of 22 SAP patients
2.2 病原体检出情况
52份血标本中，BC阳性17份(32.7%)，分离病原体29株，以凝固酶阴性葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌为主；ddPCR检测阳性41份(78.8%)，检出病原体73株，以肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、肠球菌为主。ddPCR检测前7日内患者引流液、痰、胆汁等34份体液标本的细菌培养效果瓦解，共分离病原体51株。见图 1。41.2%的BC阳性及46.3%的ddPCR阳性血标本中检测到两种及以上病原体。见图 2。
图 1 SAP患者血标本BC、ddPCR检测及非血标培养痾原菌散布情况
Figure 1
Pathogen distribution of blood specimens from SAP patients by BC and ddPCR as well as non-blood specimens by bacterial culture
图 2 ddPCR和BC单次检测出病原体种类散布
Figure 2
Distribution of pathogen species in single detection by ddPCR and BC
2.3 ddPCR检测的会诊遵守
在ddPCR检测范围内，共有50份血标本检测效果纳入会诊遵守的野心，放手的2份血标本BC检测效果为陷落假单胞菌和食酸代夫特菌，不在ddPCR检测范围内。以BC为金尺度，两种规范一致阳性12份，一致阴性10份，总体一致性为44.0%(22/50)，ddPCR的智慧度为80.0%(12/15)，特异度为28.6%(10/35)，阳性展望值和阴性展望值分别为32.4%(12/37)、76.9%(10/13)；在推敲可能BSI之后，ddPCR的智慧度为91.9%(34/37)，特异度为76.9%(10/13)，阳性展望值和阴性展望值分别为91.9%(34/37)、76.9%(10/13)。见表 2、图 3。
表 2 ddPCR在病原学会诊中的遵守 Table 2 Efficacy of ddPCR in etiological diagnosis
注：+示意阳性；-示意阴性。
图 3 方向范围内ddPCR和BC的检测情况及效果
Figure 3
Detection results of ddPCR and BC in targeted range
2.4 病原菌载量与感染主义的计议性
计议性分析瓦解，在ddPCR检出的阳性血标本中，病原菌载量值与检测当日的CRP、PCT水平呈正计议(均P＜0.05)，与检测当日的体温峰值、SOFA评分、MODS评分、白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数均未见昭着计议性(均P＞0.05)。见表 3。
表 3 病原菌载量与感染主义的计议性 Table 3 Correlation between pathogen load and inflammatory parameters
2.5 耐药基因散布
17份BC阳性的血标本中12份AST阳性。41份ddPCR阳性血标本中28份检出耐药基因，其中blaKPC阳性19份，blaNDM/IMP阳性9份，VanA/VanM阳性6份，mecA阳性5份。6份ddPCR检出VanA/VanM基因的血标本中，5份(83.3%)肠球菌阳性；5份检出mecA基因的血标本中，4份(80.0%)葡萄球菌阳性。12份AST阳性血标本中，ddPCR耐药基因检测阳性9份(75.0%)，其中8份(66.7%)耐药基因效果等同或包含AST效果，不一致的4份标本中存在2份漏检，2份未在ddPCR检测范围内。
3 商量BSI是天下范围内一个焦炙的全球卫生问题，延伸的感染源规章与不充分的抗感染颐养会权贵加多患者示寂风险并影响永远预后[15-17]。2021年《脓毒症和脓毒症休克处分海外指南》强调：关于可能患有脓毒症或脓毒症休克的成东谈主，应在1 h内赐与抗菌药物[18]。由于BSI的症状艰苦特异性、BC阳性率低及存在滞后性，在BSI病原学早期会诊、感染进度分层、抗菌药物精确使用及疗效监测等方面存在诸多清贫。
ddPCR行为一种新兴的分子会诊工夫，不依赖尺度弧线即可对方向序列进行完全定量检测[12]，当今已庸碌利用于无创产前基因检测和肿瘤的液体活检[19-20]；同期，在感染性疾病的会诊中也瓦解出了遍及后劲[21]。本研究瓦解，ddPCR在耗时方面昭着优于BC，此为BSI病原学早期会诊，精确一样抗菌药物使用提供了可能；同期，包括AP在内的很多无菌性炎症在发病早期具有发烧、炎症主义升高档易与感染相稠浊的进展[22]，ddPCR的使用将有助于临床大夫对其进行鉴识。推敲到BC存在一定假阴性率[23]，本研究整合了检测前1周内非血标本细菌培养效果来空洞判定BSI的可能，使ddPCR的智慧度和特异度分别进步至91.9%、76.9%，与既往研究[24]报谈一致。值得预防的是，ddPCR和BC在2份血标本中均检测到念珠菌，况且既往研究[14， 25]也证据了ddPCR关于真菌的会诊性能。
BC阳性血标本中，有3份ddPCR检测为阴性，在既往研究[21， 26]中有雷同报谈，连合BC常见浑浊菌散布[6]，推敲其中2份血标本BC分离的溶血性葡萄球菌为采样时混入的皮肤定植菌；另外1份血标本BC分离出多种细菌，ddPCR漏检了其中的黏质沙雷菌和暗沟肠杆菌，笔者以为可能是由于ddPCR检测血浆中病原体DNA片断，存在DNA突变或在菌种过多时存在互联系扰的情况，进而影响检测的精确度，还需要更多的基础研究来证据。
在当年几十年中，有250余种脓毒症计议生物标记物被研究用于辅助临床决策[18， 27]，CRP和PCT等行为现时研究和利用最庸碌的生物标记物，一定进度上反应了机体对病原体的免疫反应强度[28]。本研究瓦解了ddPCR阳性血标本中病原菌DNA载量值与检测当日的CRP和PCT水平呈昭着的正计议关系，标明ddPCR在检测出病原体种类的同期，也能较直不雅地反应感染的严重进度[29-30]；况且，凭借其完全定量的特点，为抗感染疗效的动态监测提供可能[31]。
频年来，不休有新兴的检测规范利用于感染病原学畛域[8， 32-33]，其中，宏基因组二代测序(meta-genomic next-generation sequencing， mNGS) 利用庸碌并在脓毒症、核心神经系统感染、组织感染等感染性疾病的病原体检测中逐渐受到招供[34-36]。有研究[37]相比了mNGS与ddPCR关于BSI的会诊遵守，效果标明在ddPCR检测范围内，ddPCR具有更高的智慧度和更短的检测耗时，然则mNGS具有更广的检测范围，况且在陌生病原体的会诊上具有上风。笔者以为，ddPCR在利用方面还需推敲以下几点：当先，基于检测血浆中微生物游离DNA(mcfDNA)的规范[38]，ddPCR受病原体糊口景况影响小，使其在检测中具有踏实性和可重叠性，但无法诀别血液中的病原菌处于存活或失活状态；同期，尚穷乏病原菌DNA载量值界说BSI临床会诊及判定抗菌药物最好脱手时机阈值的计议研究。其次，尽管本研究在ddPCR检测的无数血标本中呈现了菌种与耐药基因型的对应关系，但ddPCR检测出的耐药基因型不等同于表型，且在多种病原菌感染时较难详情耐药基因源于何种病原菌，使其在一样抗感染药物使用时存在一定局限性。因此，怎么将ddPCR更好地利用到临床实行中还需要更多高质地的前瞻性研究来明确。
本研究存在一定局限性。当先，该研究是在单中心进行的，行为探索性研究样本量较小；其次，未能评价和探讨ddPCR在动态监测个体抗感染疗效、改善患者预后方面的遵守。
总而言之，ddPCR行为一种辅助BC会诊BSI的检测规范具有智慧度高、耗时低等上风，对BSI病原体及耐药基因的快速检测具有一定的会诊真义，改日还需要更多前瞻性研究去探究其在一样抗菌药物使用、疗效动态监测及改善患者预后等方面的临床价值。
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